علوم آزمایشگاهی

انواع محیط های کشت باکتریایی روتین در آزمایشگاه

.بلاد اگار :

اغلب نمونه هاي رسيده به آزمايشگاه ميكروب شناسي بر روي محيط آگار خوندار كشت داده مي‌شوند، چون اين محيط از رشد تمام واغلب باكتريهاي سخت رشد حمايت كرده و اغلب ميكروب شناسان عادت دارند بر اساس مورفولوژي كلني بر روي آگار خوندار تصميم گيري نمايند . اين محيط از يك محيط پايه مانند تريپتون كه منشاء پروتئيني دارد، كلريد سديم آگار و 5 درصد خون تشكيل شده است . برخي باكتريها آنزيم هاي خارج سلولي توليدكرده كه بر روي گلبول‌هاي قرمز عمل كرده و آنها راكاملاً ليز مي‌كند (هموليزبتا ) يا يك تغيير سبز رنگ در اطراف كلني ايجاد مي‌كند ( هموليز ناقص يا آلفا ) در صورتي كه برخي از باكتريها تغييري ايجاد نمي‌كنند ( هموليزگاما) توليد هموليزين بوسيله باكتري به بسياري از فاكتورهاي محيطي مانند PH ، اكسيژن و دما بستگي دارد. ميكروب شناسان اغلب از مورفولوژي كلني و توليد هموليزين به عنوان آزمايشات غربالگري اوليه جهت كمك به تصميم در انتخاب مراحل ديگر جهت شناسايي يك باكتري استفاده مي‌كنند. جهت مطالعه درست واكنش هموليتيك بر روي آگار خوندار، كارشناس بايستي پليت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نمايد. اگر از لوپ جهت كشت خطي بر روي آگار خوندار استفاده مي‌شود بايد آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانيسم بتواند در زير سطح محيط كه اكسيژن كمتري دارد رشدكند . توليد هموليزين هاي حساس به اكسيژن در برخي از ارگانيسم ها بدين وسيله تشديد مي‌گردد . به روش ديگر، مي‌توان پليت‌ها را جهت مشاهده واكنش هموليزين حساس به اكسيژن به طريق بي هوازي نيز انكوبه نمود.

2.محيط شكلات آگار(Chocolate agar):

در ساختن اين محيط از محيط آگار استفاده مي شود . پس از آماده نمودن و استريل كردن محيط پايه ، خون را هنگامي كه هنوز داغ است ( در حدود 0c85 ) به آن اضافه مي كنيم .گلبولهاي قرمز در اين حالت ليز شده و محيط رنگ شكلاتي ـ قهوه اي به خود مي‌گيرد . اكنون هموگلوبين و ساير مواد مغذي موجود در گلبولهاي قرمز درمحيط وجود دارند . همين ( Hemin ) كه فاكتور x خوانده مي شود و كوآنزيم نيكوتين آدنين دي نوكلئوتيد (NAD) كه فاكتور V خوانده مي‌شود ، به عنوان مكمل به محيط پايه آگار غني از مواد مغذي اضافه مي‌گردند . نايسريا گونوروه و گونه‌هاي هموفيلوس در ميان ساير ارگانيسم هاي سخت رشد، رشد بهتري درحضور مواد مغذي مكمل اضافه شده به شكلات آگار دارند .

3.مانیتول سالت آگار(MSA) :

يك محيط انتخابي به منظور جداسازي استافيلوكوكهاي بيماريزا ( كوآگولازمثبت) از نمونه هايي كه حاوي باكتريهاي متعدد هستند بكار مي رود .

غلظت زياد نمك 5/7% موجود در اين محيط مانع از رشد كوكسيهاي غير بيماريزا مي شود . پس از كشت بايد محيط را در 37oC بمدت 36 ساعت انكوبه كرد . تخمير قند مانيتول توسط باكتري مورد آزمايش ، بوسيله معرف فنل ـ رد موجود در محيط مشخص مي‌گردد . پس از انقضای مدت انكوباسيون ، استافيلوكوك هاي غير بيماريزا بر روي اين محيط ، كلني هاي كوچك و سفيد تشكيل مي دهند كه با هاله اي ارغواني يا قرمز احاطه مي شوند . در حاليكه كلني استافيلوكوكهاي بيماريزا زرد رنگ بوده و هاله زرد رنگي نيز آنها را احاطه مي كند .

طرز تهيه :

1- محيط را پس از حل كردن در آب مقطر به كمك حرارت مرطوب به مدت 15 دقيقه توسط اتوكلاو استريل نماييد .

2- پس از آنكه دماي محيط به 45-50oc رسيد ، آنرا در پليت هاي استريل تقسيم نمائيد . 

4.مک کانکی اگار :

مك كانكي آگار معمولترين محيط كشت انتخابي ـ افتراقي بوده وداراي رنگ كريستال ـ ويوله جهت ممانعت از رشد باكتريهاي گرم ـ مثبت و انديكاتور قرمز خنثي (Nautral red) جهت نشان دادن خصوصيات افتراقي مي باشد . با سيل هاي گرم ـ منفي به‌آساني بر روي اين محيط رشدنموده و باكتريهاي تخمير كننده لاكتوز ، محصولات اسيدي توليد نموده كه سبب كاهش PH در محيط اطراف كلني مي گردد . انديكاتور قرمز خنثي در PH اسيدي قرمز رنگ مي‌شود . پس ميكروارگانسيم هاي لاكتوز ـ منفي بي رنگ و شفاف مشاهده مي شوند . مك كانكي آگار محيط انتخابي و افتراقي مورد استفاده جهت گونه‌هاي شيگلا مي باشد .

طرز تهيه محيط E.M.B و M.C مثل تهيه محيط نوترينت آگار مي‌باشد .

  • باکتری های گرم منفی انتروباکتریاسه مانند اکلای و انتروباکتر ائروزنس لاکتوز را تخمیر می کنند .
  • اکلای کلنی های صورتی مایل به قرمز که گاهی در محیط با هاله ای قرمز رنگ در اطرافش مشخص میشود.
  • کلنی های انتروباکتر ائروزنس موکوئیدی صورتی مایل به قرمز هستند .
  • باکتری های گرم منفی پروتئوس ولگاریس و سالمونلا تیفیموریوم  در محیط مک کانکی آگار رشد می کنند اما قند لاکتوز را تخمیر نمی کنند. در این حالت رنگ محیط کشت زرد و یا صورتی روشن است و
    کلنی ها به صورت بیرنگ دیده می شوند و سوارمینگ از پروتئوس مهار شده است .

ترکیبات:

پپتون-لاکتوز-املاح صفراوی-آگار-قرمز خنثی یا بروموکرزول-آب مقطر

5.محیط EMB (ائوزین متیلین بلو اگار) :

يك محيط افتراقي در بردارنده لاكتوز با پپتون وائوزين متيلن بلو است . رنگهاي انيليني موجود در محيط ( ائوزين ، متيلن بلو ) مانع از رشد باكتريهاي گرم ـ مثبت مي شوند .

اين رنگها همچنين در PH اسيدي باهم تركيب شده وايجاد رسوب مي نمايند . بنابراين مي توان از وجود آنها بعنوان شاخصي جهت تخمير لاكتوز و توليد اسيد نيز استفاده نمود .

باكتريها گرم ـ منفي بر اساس تخمير يا عدم تخمير قند لاكتوز كلني هاي صورتي و يا بي رنگ تشكيل مي دهند .

باكتري اشرشيا كلي ( E.coli ) كه لاكتوز را بشدت تخمير نموده و مقدار زيادي اسيد توليد مي نمايد، بر روي اين محيط داراي جلاي فلزي سبزرنگ مي باشد .

كلبسيلا، انتروباكتر، سراشيا كه تخميركنندگان ضعيف لاكتوز هستند بر روي محيط كلني هاي ارغواني توليد مي نمايند .

پروتئوس، سالمونلا، شيگلا كه قادر به تخمير لاكتوز نيستند بر روي اين محيط كلني هاي شفاف ايجاد مي‌كنند ..

  • باکتری های گرم منفی انتروباکتریاسه مانند اکلای و انتروباکتر ائروزنس لاکتوز را تخمیر می کنند
  • کلونی های اکلای در محیط EMB دارای جلای فلزی سبز رنگ هستند
  • انتروباکتر ائروزنس در این محیط کلنی های صورتی رنگی ایجاد می کند که گاهی دارای نقاط بنفش در مرکز انها (چشم ماهی) هستند .
  • باکتری های گرم منفی پروتئوس ولگاریس و سالمونلا تیفیموریوم  در محیط مک کانکی آگار رشد می کنند اما قند لاکتوز را تخمیر نمی کنند.
  • در ضمن در محیط EMB از قند ساکاروز هم برای تخمیر استفاده می شود .

 

6.محیط TSI (triple suger iron agar):


اين محيط بطور گسترده در تشخيص باكتريهاي روده‌اي ( اعضاي خانواده انتروباكترياسه ) كاربرد دارد. كه بصورت شيب دار در لوله آزمايش ساخته مي شود و سطح بيشتري براي رشد باكتريها فراهم مي‌آورد.  كشت در محيط جامد بصورت عمقي ‌ـ‌ سطحي مي‌گيرد .

محيط TSI حاوي معرف فنل ـ رد ، سولفات فرو ، تيو سولفات سديم ( براي تشخيص توليد گاز سولفيد هيدروژن ) و سه قند گلوگز ، لاكتوز و سوكروز است كه غلظت گلوكز درمحيط 1/0 غلظت دو قند ديگر مي باشد .

دامنه PH محيط از 8/6 تا 4/8 متغير مي باشد . اين محيط قبل از كشت به دليل داشتن معرف فنل ـ رد قرمز رنگ است .

با استفاده از TSI مي توان سه خصوصيت را در يك باكتري مشخص نمود.

الف : توانايي توليد گاز CO2 , H2 از متابوليسم قندها .

ب : توانايي توليد مقادير زيادي گاز سولفيد هيدروژن كه از طريق سياه شدن محيط مشخص مي شود .

( بي رنگ ) H2S تيوسولفات سديم + محيط اسيدي ( باكتري )

(رسوب سياه )FeS يون فريك + H2S

ج : توانايي تخمير گلوكز ، لاكتوز و سوكروز .

باسيلهاي گرم ـ منفي را بر اساس واكنش ايجاد شده بر روي اين محيط مي‌توان به پنج گروه تقسيم كرد :

در گروه I تخمير گلوكز ، لاكتوز ، سوكروز ، منتهي به اسيدي شدن ( زرد شدن ) تمامي محيط و توليد گاز مي‌گردد.

واكنش هاي ايجاد شده توسط باكتريهاي گروه III,II همانند گروه I‌ است و تفاوت آنها فقط در توليد يا عدم توليد گاز است .

هنگاميكه عمق و سطح اين محيط توسط باكتريهاي گروه IV,III كشت داده مي شود ، باكتري كشت داده شده ابتدا بطور هوازي و سپس بطريقه بي هوازي شروع به مصرف گلوكز مي‌نمايد . زماني كه هر دو طريقه در حال انجام است

( ساعات اوليه انكوباسيون ) PH‌ تمامي نقاط محيط كشت اسيدي و در نتيجه محيط زرد رنگ است اما از آنجايي كه تخمير هوازي در مقايسه با تخمير بي هوازي با سرعت بيشتري بوقوع مي‌پيوندد، گلوكز موجود در سطح به پايان رسيده و باكتريها شروع به تجزيه پپتون موجود در محيط مي‌نمايند .از تجزيه پپتون در شرايط هوازي ، بي هوازي آمونياك (NH3 ) توليد مي‌شود . محصولات اين عمل خاصيت قليايي داشته و در نتيجه رنگ سطح محيط مجدداً قرمز مي ‌شود . درهمين حال عمق محيط بدليل سير‌آرامتر تخمير بي هوازي گلوكز، همچنان اسيدي و زرد رنگ باقي مي‌ماند .

گروه V يا سيلهاي گرم ـ منفي غير تخمير كننده مانند گونه هاي سودوموناس، پپتونهاي موجود در محيط را تجزيه كرده ودر سطح و عمق محيط را بدون توليد گاز، قرمز رنگ مي‌نمايند .


مطالب ذكر شده را مي توان بصورت زير خلاصه نمود :

گروه I سطح زرد / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S منفي.

گروه II سطح زرد / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S مثبت.

گروه III سطح قرمز / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S مثبت .

گروه IV سطح قرمز / عمق زرد ، گاز منفي ، H2S مثبت.

گروه V سطح قرمز / عمق قرمز ، گاز منفي ، H2S منفي

7.محیط(KIA):

این محیط افتراقی مشابه TSIمی باشد اما فاقد قند سوکروز می باشد و فقط قند گلوکز و لاکتوز را دارد.

8.محیط سیمون سیترات آگار:

حاوی مقادیری نمک-الکترولیت ها-سیترات و معرف رنگی بروموتیمول بلو است.اگر اورگانیسم توانایی مصرف سیترات و تبدیل ان به ترکیبات قلیایی استات و کربنات  را داشته باشد رنگ معرف محیط را از سبز به آبی تغییر می دهد اما در غیر این صورتمحیط کشت به همان رنگ سبز باقی می ماند.

9.محیط SIM:

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab  تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز  در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است.قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و درصورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است ،انتشار می یابد .سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد.با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس  Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت 24 ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است .باکتریهای که حاوی مجموعه آنزیمهایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند ،باشند قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد.باکتریهای فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است،کدر می کنند.برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول :                                     

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید    ------------------   5 گرم

ایزو آمیل الکل                      -------------------  75 میلی لیتر

اسید کلریدریک                   -------------------  25 میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده واز بنماری 55-50 درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در 4 درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم .رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوهای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

10.محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth (MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرمها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن  از این محیط استفاده می شود.

آزمایش  MR: پس از انجام کشت و انکوباسیون 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت ، مقدار 6/0 میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.                                                                                                                                                                        

نتیجه: ظهور رنگ قرمز---------آزمایش مثبت  (PH=4/4)

        ظهور رنگ نارنجی-------آزمایش مثبت ضعیف(PH=5/3)

        ظهور رنگ زرد ---------آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف :MR

1-متیل رد    --------  04/0 گرم

2-اتانول      -------- 40 میلی لیتر

3-|آب مقطر --------  100 میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم 100 میلی لیتر می رسانیم .

آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود6/0 میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار 2/0 میلی لیتر محلول پتاس (معرف B)  اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آنرا به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی  تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت ،واگر تغییر رنگی صورت نپذیرد ، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه: مثبت=  ظهور رنگ صورتی تا قرمز

        منفی=  تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A :

1-آلفانفتول  -------------  5 گرم

2-الکل اتلیک مطلق-------  100 میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه(نی) شود در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B :                                                                             

1-هیدروکسید پتاسیم -----  40 گرم

2-آب مقطر  ------------  100 میلی لیتر

 

11.محیط کشت سلنیت  F براث  Selenite  F  broth

محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها .که یک محیط غنی کننده  Enrichment می باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی میگردد.میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی 24-12 ساعت اول از رشد هر یک از باکتریهای روده ای سریعتر است .بنابر این کشت ثانوی باکتری  در محیطهای دیگر باید ظرف همان روز (24-12 ساعت) انجام گردد. 

باید توجه داشت این محیط در صورت ماندن و کهنه شدن خراب شده و رنگ آن به صورتی می گراید. بنابر این هرچه کم رنگتر باشد ، تازه تر و برای کشت مناسبتر خواهد بود.

21.محیط دی اکسی کولات (XLD):

ترکیبات:پپتون-لاکتوز-سیترات سدیم-سیترات فریک-کلرو سدیم-فسفات دی پتاسیک-دی اکسی کلات سدیم-آگار-قرمز خنثی-آب مقطر

PHاین محیط حدود7.2است.

این محیط برای شناسایی میکرواورگانیسم های جنس سالمونلا و جنس شیگلامورد استفاده قرار می گیرد.این میکرواورگانیسم ها قادر به تخمیر لاکتوز نیستندو در روی این محیطها کلنی های بیرنگ تولید می کنند.انواع دیگری از باکتری ها که قادر به مصرف لاکتوز نمی باشند در روی این محیط کشت رشد نمی کنند.

Hekton  Enteric agar .13

هكتون انتريك آگار محيطي انتخابي براي جداسازي و ترميم نمونه هاي مدفوعي متعلق به باكتري هاي روده اي به ويژه سالمونلا و شيگلا است. اين محيط  باكتري هاي تخميركننده لاكتوز را از آنهايي كه نمي توانند از تخمير لاكتوز ، اسيد توليد كنند با ايجاد رنگ زرد - نارنجي روي محيط مناسب در حضور شاخص pH متمايز مي كند . باكتري هايي كه لاكتوز راتخمير نمي كنند، روي محيط تغيير رنگ ایجاد نمي دهند. هكتون انتريك آگارمي تواند توليد گاز هيدروژن سولفيد را با تيره نمودن بخش هايي از محيط  نشان دهد.

 

14.محيط سالمونلا ـ شيگلا (s.s) :

در محيط S.s تركيباتي مانند پپتون ، لاكتوز ، املاح صفراوي ، نوترال رد، آگار، بريلين گرين ، تيو سولفات سديم وجود دارد . اين محيط فقط اجازه رشد به باكتري هاي سالمونلا و شيگلا را مي دهد . بريلين گرين موجود در محيط مانع رشد باكتريهاي گرم ـ مثبت و ديگر گرم منفي ها در محيط S.s مي شود . با استفاده از اين محيط مي‌توان سوشهاي تخمير كننده لاكتوز را از سوشهايي كه توانايي تخمير لاكتوز را ندارند، تشخيص داد .

سالمونلا ، شيگلا قادر به تخمير لاكتوز نبوده، درمحيط S.s كلني هاي بي رنگ ايجاد مي كنند كه ارزش تشخيصي دارد .

طرز تهيه :

براي ساخت اين محيط مقدار مورد نياز پودر S.s را در آب مقطر ريخته و به حجم مي رسانيد آنگاه بوسيله جوشاندن پودر را در آب مقطر كاملاً حل مي‌كنيد . اين محيط احتياج به اتوكلاو ندارد .

15.محیط کشت آگار انتخابی ویبریو Vibrio selective agar (TCBS agar)

آگار تیو سولفات سیترات بایل ساکارز جهت جداسازی و کشت انتخابی ویبریوها بکار می رود. غلظت بالای تیو سولفات و سیترات و قلیایی قوی این محیط رشد انتروباکتریاسه ها را تا حد زیادی متوقف می سازد. هر باکتری که بتواند در این محیط رشد کند، قادر به متابولیزه کردن ساکارز نمی باشد. فقط چند گونه ساکارز مثبت پروتئوس می توانند رشد نموده و کلنی های زرد مشابه ویبریو تولید نمایند. اندیکاتور مخلوط تیمول بلو-بروموتیمول بلو با تشکیل اسید به رنگ زرد تغییر رنگ می دهد.(حتی با وجودی که درجه قلیائیت آن بالاست).

Mueller Hinton agar .16    

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطر و اتوکلاو نمودن , محیط را در پلیت های استریل تقسیم نمایید.

+ نوشته شده در  شنبه 22 آبان1389ساعت 1:45 PM  توسط بهزاد  |